高效液相色相谱法基本定义和方程式

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高效液相色相谱法基本定义和方程式

一切形式的色谱都是分离混合物组分的方法，有赖于各种溶质分子对于固定相和流动相的相对亲和性。

色谱方法是按照所使用的固定相和流动相的类型和它们的存在状态，以及支配分离的不同机理进行分类的。例如，可分为薄，层色谱( T-LC); 气相色谱(GC )及其次级区分气一液色谱(GLC)和气一固色谱(GSC);液一固(吸附)色谱(LSC);液一-液(分配)色谱( LLC )等等。此外，有三种可能的色谱展开方式:前沿分析，顶替法和洗脱法。通常，HPLC是与洗脱展开相联系的，但在有些情况下，主要是梯度洗脱时，其中可能存在顶替的机理。

对经典色谱分离的定性描述如下:

一支横截面约为1厘米的玻璃柱以适当的吸附剂充填到四分之三的满度，将溶于适当溶剂的样品置于柱顶端使呈均匀的谱带，然后以纯溶剂在重力作用下使之通过柱子。

在流动相的作用下，最初的谱带开始沿柱子向下迁移，其中的组分开始分离。仅受吸附剂微弱阻滞的组分，快速地通过固定床，阻滞越强的组分移动越慢，如此，直至所有组分完全得到分离。

HPLC不过是上述技术的延伸，包括使用很细的、粒度分布窄的颗粒，由输液泵产生的压力而获得的更高的流动相速度，以及当分离的组分流出色讲桂时进行指示的检测系统。

以上清楚表明，溶质谱带以不同的速度迁移通过色谱床，而这种不同的迁移速度是各组分在固定相和流动相之间平衡分配的函数。随着讲图的展开过程和组分的分离，与初始的谐带相比，各谱带也随之而展宽了。各种因子对这一展 宽效应都有影响，第2章对此将作详细的讨论。

在分配等温线(见后面)是线性的情况下，分离谱带的浓度分布是高斯型的，其变度与迁移距离z成比例。

σ2∞Z

比值因子σ2/z随许多影响因素而变化，这些因素决定于柱的填充状况和操作条件。此因子称为“理论等板高度(HETP)”或塔板高度，这是Martin和Synge l1l在描述色谱分离过程时使用的名称。

一个两组分的典型分离示于图1-1。在这个洗脱色谱图上可得到重要的信息。

图1-1提供可直接测量参数的典型洗脱色谱图

柱色谱的一个基本保留参数，即任一组分的保留体积VR，可直接从测量该组分的保留时间tR的秒数，乘以用毫升/表示的体积流速而得到。于是VR1=tR1 Fo

式中，Fo=体积流速，tR1一组分1的保留时间。同样

tR2=tR2 Fo

图1-1还有tm,这是不保留溶质的保留时间，即一个在固定相中，完全不吸附或不溶解的溶质，因此它与流动相以同一速率流过柱子。其保留体积是

Vm=tmFo

这是柱中所含有流动相总体积的一个量度;常称为柱的“死体积”。

在以上所概括的简单模型中，样品谱带在流动相的作用下，以流动相速度的一个分数流过色谱床。这一分数称为R，并可从下式求得一个化合物的R£值

样品谱带的移动速率

R£=------------------------------------

溶剂前沿的移动速率

参数R£是在干柱技术(如上所述)和TLC中测量得到的主要参数。

假定在溶质流过色谱柱的运动过程中的某一一时刻流动相停止了流动，此时，样品将在固定相和“停止的”流动相之间平衡。这一情形描述于图1-2,它表示了溶质在固定相和“停止的”流动相两者中的浓度分布图形。可看到，这两个浓度分布图除了大小可能不同而外，是完全相同的。

此时，浓度比等于分配比K，而

K=Cs/Cm

Cs、Cm分别为固定相和流动相中的溶质浓应。

图1-2溶质在固定相和“停止的”流动相中的平衡分配

获得刘称形请带的一个条件是，分配系数随样品浓度呈线性变化，如这一条件没有满足，则谱带将会歪斜，保留时间就要随样品浓度而变化(图1-3)。

如果考察长度为d㏄的一小段语带(图1-2)，则此小段中的溶质在两相中的浓度比称为柱的容量比K'，它由下式与K相联系

K'=qs/qm=Csasdx/Cmamd㏄

=Cmamd㏄

=Csas/Cmam=CsVs/CmVm

=K(Vs/Vm)

式中,as、am各为固定相与流动相的平均横截面积;Vs、Vm是柱中两相的体积; qs、qm是长度为d㏄的两相中溶质的量。K'在液相色谱中是个极重要的量，它将样品在柱中的平衡分配与柱的热力学性质联系起来。

一切平衡都是动态的，在所述的模型中，在平衡时，溶质分子在固定相和流动相之间不断地交换。

如果可能在一段时间中观察一个溶质分子，并跟踪其路径，就会发现这个分子在固定相中所停留的时间分数，接近于在某一瞬间停留在固定相中的总的分子分数，而经过无限长时间后，这两个分数在统计极限之内是相等的。因此可以写作

分子在固定相中平           9s             K'

--------------------------- = ----------- =----------

均停留的时间分数        9m+9s      1 +K'.

同样

分子在流动相中平          9m          1

--------------------------- =------------ =-------

均停留的时间分数       9m+qs     1+K’

显然，这两个分数的和应为1，因为分子必然是不在固定相中就在流动相中。

如果流动相重又开始流动，它以恒速u厘米/秒流过柱子，这会怎样呢?当溶质分子从固定相进入流动相时，它也以速度u向前流动，但当它返回固定相时就保持静止。于是，谱带的平均顺流速度将取决于流动相的速度U，以及溶质分子留在流动相中的时间分数。因此谱带的速度U谱带是

1                      1

U谱带=U（-----）=U[-------------------]

I+K            1+K(Vs/Vm)

前已定义R为谱带相对于溶剂前沿运动的速率分数，因此

1

R=-----

1+K'

或

1-R

K'=-----

R

由此可以看出，R是样品在柱内平衡分配的函数，并且因为洗脱色谱仅仅是干柱色讲的推广，这就可以将洗脱时间与这个最联系起来。这样，从图1-1对于第一个溶质就有U谱带/U=tm/t1(tm=不吸附溶质的洗脱时间，因此等于溶剂前沿通过整个柱子所需的时间。

但是

也就是说，柱的容量比是洗脱一个溶质谱带较之洗脱个不保留的谱带所多花的时间，除以不保留谱带的洗脱时间。这些量值易于从洗脱谱图上求得。K' 通过方程(1-6)与分配系数K相联系，因为K在线性洗脱色谱的条件下是一个常数，由此得出R也是常数。

分析这一情况可以看出，如果R值大，溶质即快速地通过柱子。假如容质的迁移速度U谱带等于流动相速度U乘以溶质在流动相中花费的时间分数R，就有

U谱带情将=UR

当R=0时，谱带完全不迁移(U谱带=0)，而当R=1时，谱带与流动相以同一速度迁移，即U谱带=U。这时U谱带=L/tr,此处L=柱长，U=L/tmO于是根据方程(1-14)

tM

tR=----

R

但是tR=VR/F0(方程1-3)和tm=Vm/F0(方程1-4)因此，

Vm

Vr=-----

R

从方程( 1-10 )可得

VR=Vm(1+K')

或从方程( 1-6 )

VR=Vm+KVs

方程( 1-18 )是色谱中的基本方程。它将组分的保留体积与柱的死体积及分配系数和所用固定相体积的乘积联系起来。

本方程对于分配柱是正确的，但对于吸附柱则K要由A;(吸附剂的表面积)或W。(所用吸附剂的量)来代替。

因为Vm对于分离过程不发生作用，而且对混合物的所有组分都是恒定的，所以常常使用调整的或净保留体积Vn;

Vn=VR-Vm= KVs

假如分离过程中同时有几种独立的保留机理在起作用，例如在离子交换色谐中，分离作用同时可伴有吸附和分配两种效应，因此最终的Vn是各别机理的各个Vⁿ的总和。

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